Лилия Селиванова, Москва, 30 лет

Энтеральная нервная система и ее связь с гранулематозным воспалением при болезни Крона

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) аутоиммунного характера, к которым относится язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), занимают среди болезней желудочно-кишечного тракта особое место, находясь под пристальным вниманием ученых всего мира. В первую очередь, их исключительная значимость связана с неуклонным ростом заболеваемости и распространенности, тяжестью поражения, широтой внекишечных клинических проявлений, а также недостаточным, несмотря на ногочисленные исследования, пониманием этиологических и патогенетических механизмов, что влияет на эффективность разработки адекватных лечебных стратегий (D.C. Baumgart 2009; N.A. Molodecky и др. 2012, . Hovde, B.A. Moum 2012).

Эпидемиологические данные ВЗК характеризуются широкой географической изменчивостью. Происходящие изменения в экологической обстановке, воздействие факторов внешней среды, в том числе инфекций, характера питания, использования медикаментов, способствуют сдвигам в глобальной распространенности заболевания.

https://www.youtube.com/watch?v=ytpolicyandsafetyru

Общемировая заболеваемость ВЗК в целом постепенно увеличивается, при этом ее наибольший рост наблюдается, первую очередь, западных развитых странах, то поддерживает гипотезу о взаимосвязи заболеваемости с «вестернизацией» образа жизни. Высокие показатели заболеваемости ВЗК отмечаются Великобритании, Европе, Канаде и Соединенных Штатах Америки, самые высокая распространенность ЯК и БК наблюдается в Европе и составляет 505 и 322 на 100 тысяч населения соответственно.

Ежегодная заболеваемость БК наивысшая в Северной Америке (20,2 на 100 тысяч человек), а ЯК — в Европе (24,3 на 100 тысяч). Заболеваемость ВЗК в целом в Западной Европе в два раза выше, чем в Восточной. Отмечено, что в последние годы заболеваемость значительно увеличилась в странах Азии и на Ближнем Востоке (6,3 на 100 тысяч) (N.A. Molodecky и др. 2012, J. Burisch, P. Munkholm 2013, A. Ponder, M.D. Long 2013, S.C. Ng 2014).

В Российской Федерации в настоящее время единые данные о распространенности и заболеваемости ВЗК отсутствуют. По результатам немногочисленных эпидемиологических исследований, проведенных в регионах РФ, распространенность в европейской части России составляла в конце прошлого века 3,7 и 20,4 случаев на 100 тысяч для БК и ЯК соответственно.

Заболеваемость БК при этом 0,3 на 100 тысяч, ЯК — 1,7 на 100 тысяч населения. В настоящее время ситуация в целом аналогична. Среди больных в РФ преобладают жители индустриально развитых населенных пунктов (городские жители), что соответствует общемировым данным. Особенностью нашей страны является значительное преобладание среди впервые выявленных ЯК и БК тяжелых форм заболевания, что обусловлено поздней диагностикой.

Это приводит к значительным сложностям в лечении и, как следствие, высокой летальности среди таких пациентов (И.В. Никулина, А.Р. Златкина, Е.А. Белоусова 1997, Ю.М. Степанов, Н.С. Фёдорова 2010; А.В. Ткачев, Л.С. Мкртчян, К .Е. Никитина 2011, А.Ю. Барановский, Э.А. Кондрашина, А.М. Сегаль 2013; Е .С. Бодрягина, Д .И. Абдулганиева, А.Х. Одинцова 2013).

Установлено, что ВЗК возникают в результате неадекватного иммунного ответа на кишечные антигены у генетически восприимчивых лиц . При этом поражение преимущественно локализуется в желудочно-кишечном тракте , но может захватывать и другие системы и органы. Иммунологические нарушения затрагивают практически все ступени деятельности иммунной системы кишечника, от повреждения эпителия и его барьерной функции до патологии макрофагов, Т — и В -лимфоцитов (D.C.

Baumgart 2009; А.В. Ткачев, Л .С. Мкртчян 2011). Важными факторами, способствующими формированию патологического иммунного ответа, являются раса и этнические особенности индивидуума, среда проживания (географическая характеристика), образ жизни, наличие инфекций (D.C. Baumgart 2009). Значимую роль играют генетические факторы (идентифицировано 163 гена/локуса, ассоциированных с высоким риском ВЗК).

Интересно, что большая часть локусов риска ВЗК связана также с другими иммуно-опосредованными заболеваниями (W.E. Ек, М. D Amato, J. Halfvarson 2014). Другим доказанным патогенетическим механизмом ЯК и БК является формирование иммунного ответа на компоненты нормальной кишечной микрофлоры, то есть на микробные антигены.

Влияние кишечных бактерий на развитие и проявления ВЗК является одним из важных направлений изучения патогенеза этих заболеваний (C.G. Yu, Q. Huang 2013,1. Koboziev и др. 2014). Еще одним немаловажным аспектом в формировании ВЗК является нейроэндокринная регуляция желудочно-кишечного та и функционирование энтеральной нервной системы.

Лилия Селиванова фото

Патогенез ВЗК представляет собой сложный и многофакторный процесс, основанный на взаимодействии иммунных, генетических, нейроэндокринных механизмах регуляции, лучшее понимание которых может стать основной для определения точки приложения лечебного воздействия.

Морфологические методы

Материал, полученный от пациентов фиксировали в 10% забуференном формалине, обрабатывали в аппарате гистологической проводки фирмы «Leica» и заливали в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материала не превышало, как правило, 48 часов. Затем готовили серийные срезы (не менее 10) толщиной 3-4 мкм, которые помещали на полилизиновые стекла (Leica, Германия) и инкубировали в термостате при температуре 370C в течении 12 часов .

Иммуногистохимические методы

Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах, изготовленных из биопсийного материала, взятого из подвздошной кишки. Иммуногистохимическое исследование проводилось на срезах толщиной 3 мкм, расположенных на стеклах с полилизиновым слоем (Leica, Германия). Исследование проводили на полностью автоматизированном иммуногистостейнере Leica Bond max (Германия), позволяющим депарафинизировать срезы, проводить инкубацию с антителами при постоянной заданной температуре, проводить энзиматическую демаскировку антигенов, высокотемпературную демаскировку антигенов в буферах pH 6,0 и 8,8, подкрашивать препараты гематоксилином.

https://www.youtube.com/watch?v=ytadvertiseru

Экспрессия цитоплазматических маркеров Хромогранин А, CD3 проводилась путем подсчета позитивно окрашенных клеток. Учитывая особенности окрашивания цитоплазмы маркером CD68 (гранулярный характер окрашивания) оценка проводилась полуколичественно.

Экспрессия РС2 в клетках оценивалась следующим образом: мембранное, мембранно-цитоплазматическое и цитоплазматическое окрашивание. Морфометрические методы Все препараты были отсканированы на сканирующей системе Aperio фирмы Leica — уникальной системе получения высокоточных изображений гистологических препаратов, позволяющей создавать полноценное изображение, которое можно многократно увеличивать, просматривая отдельные фрагменты в в ысоком качестве максимально приближенному к тому, которое традиционно получают с помощью обычного микроскопа.

Программная обработка изображения позволяет проводить качественный и количественный анализ препарата. Рисунок 1. Система сканирования гистологических препаратов Aperio (Leica, Германия). Подсчет CD3 позитивных окрашенных клеток (интраэпительных лимфоцитов) производился на поверхности слизистой одной ворсины (в среднем на 100 клеток), однако, учитывая вариабельность размера ворсин, все ворсины были разделены на две группы.

В первую вошли крупные ворсины, поверхность которых насчитывала приблизительно 100 и более эпителиальных клеток (размер от 401 m и более) во вторую группу вошли ворсины среднего и маленького размера, эпителий которых насчитывал менее 100 клеток (от 400 m и менее). В результате было получено 2 цифровых показателя для каждой группы (БК, НК и контрольная группа), благодаря чему было проведено сравнение содержания Т-лимфоцитов в сравниваемых группах.

Учитывая вариабельность расположения крипт в илеобиоптатах, подсчет количества хромогранин А позитивных нейроэндокринных клеток был проведен исходя из расчета на одну крипту и на ворсину подвздошной кишки, срезанных продольно. В результате было получено два цифровых показателя по каждому изучаемому случаю (для нормальной слизистой, в случае БК и НК), что позволило провести сравнение содержания НЭК в разных группах.

При подсчете РС2 позитивных клеток каждом из биоптатов было выбрано не менее 10 участков для подсчета позитивно окрашенных клеток. В связи с полиморфной картиной окрашиваемых позитивно структур, помимо общего числа РС2 позитивных клеток, был произведен так же подсчет клеток в зависимости от особенностей окрашивания.

Статистические методы

arrow

Статистическая обработка полученных результатов выполнена с помощью программы Microsoft Office Exсel 2006, STATISTICA for Windows v.6.0. Для полученных переменных при помощи построения гистограмм с расчетом среднего значения проверялось, подчиняю тся ли значения нормальному распределению. Поскольку полученные распределения значительно отличались от нормальных при анализе применялись непараметрические методы.

Роль гормонов и нейропептидов в регуляции иммунного ответа при воспалительных заболевания кишечника

Результаты гистологического исследования биопсий подвздошной кишки не всегда позволяют установить диагноз БК, однако, по данным, полученным в ходе нашего исследования, в большинстве случаев они играют ключевую роль в диагностике БК — диагноз может быть поставлен на основе олько гистологических характеристик, даже лучае отсутствия обнаружения макроскопических изменений при эндоскопическом исследовании.

Для морфологической верификации необходимо проводить исследование т.н. «лестничных» биопсий подвздошной толстой кишки. При изучении биоптатов следует обращать особое внимание на обнаружение эпителиоидно-клеточных (саркоидных) гранулем, очаговых скоплений гистиоцитов (микрогранулем), одиночных гигантских клеток, повышение плотности лимфо-плазмоцитарного инфильтрата, структурную перестройку слизистой оболочки, повреждение и воспалительную инфильтрацию клеток покровного эпителия и эпителия крипт, появление слизистых желез в биоптатах подвздошной кишки (слизистая метаплазия) и появление клеток Панета в основании крипт в биоптатах толстой кишки (панетовская метаплазия), очаговый арактер обнаруживаемых изменений при сохранении ии повышении количества бокаловидных клеток (гиперкриния).

https://www.youtube.com/watch?v=ytdevru

В 18 случаях обнаруживалась псевдопилорическая железистая метаплазия. Она заключалась в появлении в собственной пластинке слизистой оболочки желез, содержащих слизистые клетки и структурно напоминающие пилорические железы антрального отдела желудка. В связи с этим они получили название псевдопилорической метаплазии.

Важным гистологическим критерием илеита при болезни Крона считается обнаружение псевдопилорической метаплазии, которая по данным литературы возникает на месте заживших эрозий и язв, в связи с чем одним из синонимов ее является «ульцерогенная» метаплазия. Тем самым можно предположить об имевшем место у больного ранее перенесенном эрозивно-язвенном илеите.

Исходя из принятых на сегодняшний день морфологических критериев, обнаружение гранулем гистологических срезах является ключевым гистологической диагностике БК, поэтому мы решили представить обнаруженные нами особенности гистологического строения гранулем пациентов с болезнью Крона.

Согласно определению гранулема — это скопление клеток моноцитарно-макрофагальной природы в сочетании с другими клетками воспаления (Freeman HJ., 2007). Макрофаги представлены крупными клетками с обильной эозинофильной цитоплазмой и крупным овальной формы ядром. Они образуют скопления — кластеры. Из-за их схожести с эпителиальными клетками они получили название эпителиоидных клеток.

Согласно некоторым авторам классическая гранулема при БК содержит 5 или более эпителиоидных клеток в сочетании или без гигантских клеток. Клетки гранулемы могут иметь плотное компактное расположение и напоминать саркоидную гранулему, но чаще при БК отмечается более «свободное» рыхлое расположение клеток в гранулеме.

Некроз в центре и казефикация гранулемы встречаются при БК крайне редко и заставляют заподозрить туберкулез. Гигантские клетки могут содержать кальцифицированные астероидные тельца (Rubio С.А., Orrego А., 2007). Другими клетками, выявляемыми в гранулеме являются лимфоциты. Обычно это CD4 T клетки, экспрессирующие на своей поверхности рецептор CD28, который в свою очередь является лигандом для относящихся к семейству B7-связанных поверхностных белков-рецепторов CD80 (B7-1) и CD86 (B7-2) (Geboes K., 2000).

Необходимо отличать истинную гранулему при БК от микрогранулемы. Микрогранулема меньше по размерам и состоит из гистиоцитов, которые также как и эпителиоидные клетки, имеют моноцитарно-макрофагальное происхождение. Однако гистиоциты меньше х морфологические характеристики отличаются от таковых у эпителиоидных клеток типичной гранулемы при БК.

В микрогранулеме также отмечается уменьшение количества гистиоцитов по сравнению с истинной гранулемой, в тоже же время число лимфоцитов оих образованиях иблизительно равно. Микрогранулема обычно локализуется в верхних отделах собственной пластинки слизистой оболочки (Капуллер Л.Л., Конович Е.А, 2012).

Частота обнаружения микрогранулем при БК точно не определена, но скорее всего варьирует пределах 12-24%. Знчение микрогранулем и их подробное изучение пока еще не проводились. Чаще микрогранулемы обнаруживают в неактивную стадию болезни (Pierik M. et al, 2005). Гранулемы необходимо также дифференцировать гранулематозными крипт-абсцессами (крипт-абсцессы, содержащие гигантские клетки вместе с гистиоцитами или без них) и с криптолитическими гранулемами.

Гранулемы могут обнаруживаться в неизмененной слизистой оболочке или на фоне воспалительных изменений последней. Они могут локализоваться о всех слоях стенки кишки, о аиболее часто — в подслизистой основе. Их можно обнаружить в регионарных лимфатических узлах приблизительно 20-50% случаев. Частота обнаружения гранулем при БК в нашей работе составила 30%, по данным литературы этот показатель варьирует в широких пределах от 3 до 85%, но крайне редко превышает 50-60%.

Получаемые результаты во многом зависят от исследуемого материала (количество биоптатов, количество исследуемых срезов, биопсийный или хирургически удаленный материал). Для хирургически удаленного материала частота обнаружения гранулем варьирует в пределах 15-82%, а для эндоскопических биопсий этот показатель составляет 3-56%.

Таким образом, в результате проведенного исследования удалось установить достоверные различия между числом НЭК и интраэпителиальных лимфоцитов при ВЗК и в норме и получить статистически достоверную взаимосвязь между повышением НЭК и CD3 клеток в подвздошной кишке и наличием воспалительного процесса.

Таким образом, подтверждены существующие на сегодняшний день гипотезы о роли в возникновении и развитии ВЗК иммунологического (в частности -клеточного) и нейроэндокринного факторов. Помимо этого, проведенное исследование наглядно демонстрирует однонаправленный характер процессов, происходящих при ВЗК в иммунной и нейрогуморальной системах кишечника (увеличение как числа НЭК, так и количества интраэпителиальных лимфоцитов при ВЗК по сравнению с нормой).

Результаты, полученные при оценке изменений числа НЭК, могут быть объяснены с позиций повышения регенераторной активности и пролиферации НЭК воспаленной подвздошной кишке. Повышенное количество НЭК может также отражать нарушения при воспалительных заболеваниях кишечника в нейроэндокринной системе кишечника.

Данные о количественной оценке числа интраэпителиальных лимфоцитов встречаются крайне редко. По результатам немногочисленных исследований, посвященных количественной оценке числа Т-клеток в подвздошной кишке, было установлено, что при лимфоцитарном и коллагенозном колитах число интраэпителиальных лимфоцитов составляет от 0 до 4 (H. Sapp и др. 2002, V. Padmanabhan и др. 2003) клеток. Количественные данные, касающиеся изменений в местном Т-клеточном иммунитете при ВЗК отсутствуют.

В результате проведенного исследования, при подсчете интраэпителиальных Т-лимфоцитов на поверхности ворсин было отмечено, что их число значительно выше при БК и НК, по сравнению с нормой, что подтверждает роль Т-клеточного звена в возникновении и развитии БК. При сравнении числа интраэпителиальных лимфоцитов на 100 и более эпителиальных клеток ворсины в контрольной группе, с результатами ранее проведенного исследования по изучению CD3 клеток у здоровых людей в илеобиоптатах (Y.Zhang, и др.

Исследование показало, что изучаемые маркеры можно использовать в качестве дополнительных признаков для морфологической диагностики БК в илеобиоптатах. Одновременное увеличение НЭК и Т-клеток при проведении ИГХ исследования илеобиоптатов с антителами к Хромогранину А и к CD3 свидетельствует о развитии воспалительной реакции.

При количественной оценке данных критериев целесообразно использовать следующие реверсные значения: при подсчете НЭК среди эпителия одной ворсины или крипты, срезанной продольно, число окрашенных антителом к Хромогранину А клеток 10 следует рассматривать, как подозрительный в отношении возникновения ВЗК критерий, и должно насторожить морфолога.

https://www.youtube.com/watch?v=https:accounts.google.comServiceLogin

Количество НЭК в илеобиоптатах 20 можно считать диагностическим критерием, и в случае сомнений в диагнозе, склоняться в пользу ВЗК. Повышение числа Хромогранин А позитивно окрашенных клеток должно сочетаться с увеличением интраэпителиальных Т-лимфоцитов. Однако, как показывают полученные данные, различия при подсчете числа интраэпителиальных Т-лимфоцитов при ВЗК и у здоровых пациентов более очевидны при подсчете СОЗ клеток на 100 и более энтероцитов одной ворсины (при размере ворсины от 401 т и более).

В результате проведенного исследования не удалось установить достоверных различий между числом исследуемых маркеров при БК и НК. Этот факт можно объяснить тем, что при изучении илеобиоптатов в случае, когда диагноз не совсем ясен, многие морфологи ставят диагноз НК при малейшем сомнении по поводу наличия у пациента БК.

То есть можно предположить, что основная масса случаев, обозначенных, как НК, на самом деле являются БК. Помимо этого , полученные результаты еще раз подтверждают общность данных заболеваний и, возможно, ставит под вопрос правомерность использования диагноза НК. Однако как при расчете НЭК, так и интраэпителиальных Т -лимфоцитов, при НК было выявлено незначительное превышение обоих показателей по сравнению с БК.

https://www.youtube.com/watch?v=ytaboutru

Данные изменения могут быть объяснены тем, что случаи, при которых диагностируется НК, являются первой манифестацией аутоиммунного воспалительного процесса при БК. То есть к моменту получения илеобиоптатов, выраженные морфологические изменения, характерные для классической картины БК, еще не успели развиться, а острота воспаления, напротив, находится на своем пике.

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Энциклопедия про рак
Adblock detector